hoechst可以穿過(guò)活細胞膜與細胞核結合 (主要為凋亡活細胞)在紫外光下
將核染為藍色. Hoechst染細胞核會(huì )影響共聚焦顯微鏡對該樣本其他熒光的觀(guān)察效果.hoechst有hoechest33342和hoechst33258兩種 hoechsts33258,hoechst33342二者區別不大,但是hoechst33342對細胞的毒性作用更小一些,所以一般來(lái)說(shuō)hoechsts33258用于細胞固定后再染色,而hoechst33342則可以對活細胞直接進(jìn)行染色!
PI (Propidium Iodide碘化丙啶)染色
是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑,常用于細胞凋亡檢測. 碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一種核酸染料(紅色),它不能透過(guò)完整的細胞膜,但凋亡中晚期的細胞和壞死細胞由于細胞膜通透性的增加,PI 能夠透過(guò)細胞膜而使細胞核染紅.用PI單一染色觀(guān)測培養細胞,只能表示細胞的壞死情況,而不是凋亡(當然晚期凋亡PI亦可著(zhù)色)。但是如果您只是想知道細胞的死亡情況,而不是仔細區分壞死或凋亡,那么PI單一染色也可以。但是如果您一定要認定細胞的凋亡,那么PI單一染色顯然不夠!
細胞凋亡早期,細胞膜標志發(fā)生改變.其中,磷脂酰絲氨酸
(Annexin-V,PS)外翻 ,Annexin-V 在Ca+存在的條件下與其高親和力特異性結合.這樣,Annexin-v 染色陽(yáng)性,表示細胞處于早期凋亡狀態(tài).Annexin-V結合不同的熒光抗體,就可以利用流式細胞儀、熒光顯微鏡以及共聚焦激光掃描顯微鏡檢測細胞凋亡的發(fā)生。Annexin V用FITC標記發(fā)綠色熒光;如果用PE標記就發(fā)紅色熒光。
JC-1是一種陽(yáng)離子染料,可以在線(xiàn)粒體內聚集,低濃度時(shí)主要以單體(monomer)存在,發(fā)射光以綠光(~525nm)為主;而在高濃度時(shí)則可以形成多聚體(aggregation),發(fā)射光以紅光(-590nm)為主。線(xiàn)粒體本身存在一定的極性
(polarization),其外膜為負極,內膜為正極。電位差由Ca2+、Na+和H+流調控。當線(xiàn)粒體狀態(tài)良好時(shí)對JC-l攝取量少,因而在線(xiàn)粒體內主要以單體的形式存在綠光強度/紅光強度的比值較高。在線(xiàn)粒體發(fā)生去極化(depolarization)時(shí),線(xiàn)粒內JC-l的濃度較高,多以多聚體的形式存在,綠光強度/紅光強度的比值降低。JC-1染色的綠光強度/紅光強度僅取決于線(xiàn)粒體的膜電勢(membrane potential),而與線(xiàn)粒體的形態(tài)、體積和密度都無(wú)關(guān),因而能更好地反映線(xiàn)粒體的功能狀態(tài)。由于凋亡發(fā)生的早期存在線(xiàn)粒體的去極性,因此,JC-1染色被用于檢測凋亡的早期發(fā)生。其實(shí)驗方法如下。
JC-l染色非常簡(jiǎn)單。首先可將成品JC-1以DMSO配成儲存液(1~5mg/ml),儲存于-20℃,用時(shí)以培養液稀釋至10ug/ml終濃度。對貼壁細胞可以直接棄去培養液,漂洗細胞后直接加入染色液,10-30min后在熒光顯微鏡下或者激光共聚焦下觀(guān)察。線(xiàn)粒體狀態(tài)好時(shí)細胞以綠色為主,當紅光信號增強時(shí),紅綠相疊,以橙色為主。該染色運用于懸浮細胞時(shí)還可以通過(guò)流式細胞儀進(jìn)行檢測,收集紅/綠信號強度,計算其強度比。
Calcein -AM本身并不是熒光分子,但通過(guò)活細胞內的酯酶作用,Calcein -AM能脫去AM基,產(chǎn)生的Calcein能發(fā)出強綠色熒光(激發(fā):490 nm,發(fā)射:515 nm)。因此Calcein -AM僅對活細胞染色
原理:
細胞損傷或死亡時(shí),臺盼藍可穿透變性的細胞膜,與解體的DNA 結合,使其著(zhù)色。而活細胞能阻止染料進(jìn)入細胞內。故可以鑒別死細胞與活細胞。
用品:
1. 4%臺盼藍母液:稱(chēng)取4g臺盼藍,加少量蒸餾水研磨,加雙蒸水至100ml,用濾紙過(guò)濾,4度保存。使用時(shí)。用PBS稀釋至0.4%。 2. 吸管、血細胞計數板、顯微鏡
步驟:
1、制備單細胞懸液。并作適當稀釋?zhuān)?06 細胞/ml) 2、染色:細胞懸液與0.4%臺盼藍溶液以9:1混合混勻。 3、計數:在三分鐘內,用計數板分別計數活細胞和死細胞
結果統計:
鏡下觀(guān)察,死細胞被染成淡藍色,而活細胞拒染。 根據下式求細胞活力:
活細胞率(%)= 活細胞總數/(活細胞總數+死細胞總數)×100
注意事項:臺盼藍染細胞時(shí),時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)。否則,部分活細胞也會(huì )著(zhù)色,會(huì )干擾計數。
臺盼藍染色原理
通常認為細胞膜喪失完整性,細胞即可被認為已經(jīng)死亡。臺盼藍(Trypan Blue)是檢測細胞膜完整性*常用的生物染色試劑。健康的正常細胞能夠排斥臺盼藍,而死亡的細胞,膜的完整性喪失,通透性增加,細胞可被臺盼藍染成藍色。依據此原理,細胞經(jīng)臺盼藍染色后,可通過(guò)顯微鏡,直接鏡下計數或拍照后計數,實(shí)現對細胞存活率比較**的定量分析。
試述臺盼藍染發(fā)鑒別死活細胞的原理,試分析染色時(shí)間過(guò)長(cháng)本來(lái)是活細胞也被染色的原因
死細胞的細胞膜無(wú)屏障作用,臺盼藍馬上進(jìn)入細胞而顯藍色?;罴毎毎び羞x擇透性,對臺盼藍的透性小,進(jìn)入細胞慢。若染色時(shí)間過(guò)長(cháng),臺盼藍可能通過(guò)胞吞或胞飲作用進(jìn)入細胞。